The proto-oncogene c-myc in terminal B lymphocyte differentiation its role in plasma cell and memory B cell generation
- Autores: Maitane Ortiz Virumbrales
- Directores de la Tesis: Miguel Ángel Íñiguez Peña (dir. tes.), Ignacio Moreno Soriano (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2011
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Balbino Jose Alarcon Sanchez (presid.), Lourdes Planelles Carazo (secret.), Belén de Andrés Muguruza (voc.), José María Almendral del Río (voc.), Ignacio Flores Hernández (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
El proto-oncogén c-myc fue identificado como el homólogo celular del oncogén del virus de la mielocitomatosis aviar v-myc (Vennstrom et al., 1982). La desregulación de c-myc está envuelta en70.000 casos anuales de muerte por cáncer en Estados Unidos (Dang, 1999; Nesbit et al., 1999).
Por tanto, el esfuerzo para estudiar este proto-oncogén ha sido muy significativo en los últimos años, con miras terapéuticas.
c-Myc pertenece a la familia de factores de trascripción de hélice-buclehélice y cremallera de leucina (bHLHLZ), junto con N-Myc, L-Myc, B-Myc y s-Myc (Henriksson et al., 1993).
El gen c-myc está localizado en el cromosoma 8 humano y contiene 3 exones.
En el extremo carboxilo terminal c-Myc presenta el motivo bHLH-LZ para formar dímeros proteicos con Max, cuya unión es necesaria para el reconocimiento de las secuencias específicas de ADN, llamadas cajas-E (canónicas: 5¿-CACGTG-3¿, y no canónicas: 5¿-CANNTG-3¿), que se hallan en los genes diana. En la región amino terminal contiene 2 cajas Myc altamente conservadas (MBI y MBII) para transactivar sus genes diana (Dang, 1999; Pelengaris et al., 2002). La región central alberga las cajas MBIII y IV y las secuencias de localización nuclear NLS1 y NLS2, junto con varios sitios de fosforilación (Dang et al., 1988; Henriksson et al., 1993).
La proteína nuclear c-Myc se expresa de forma ubícua durante la embriogénesis y en los tejidos adultos que poseen alta capacidad proliferativa. Sin embargo, es casi indetectable en las células quiescentes o totalmente diferenciadas. c-Myc se induce rápidamente ante la exposición a estímulos mitogénicos (Campisi et al., 1984; Kelly et al., 1983; Eilers, 1991), aunque su vida media es muy corta (20-30 minutos) (Hann et al., 1984).
La familia de proteínas Mad también juega un papel en la red de factores de transcripción Myc/Max/Mad, puesto que antagonizan el efecto de Myc gracias a su capacidad para heterodomerizar con Max e inhibir la expresión génica (Hurlin et al., 1995). El balance entre dímeros Myc/ Max y Mad/Max determinará el estado de activación de sus genes diana comunes y el estado celular (Amati et al., 2001).
c-Myc está implicado en numerosas funciones biológicas, siendo las más destacables la proliferación, el crecimiento celular, la apoptosis y la diferenciación.
c-Myc promueve la progresión a lo largo del ciclo celular (Mateyak et al., 1997; Eilers et al., 1991). Esto se consigue mediante la activación de diferentes quinasas dependientes de ciclinas (CDK4, CDK2) (Steiner et al., 1995; Bouchard et al., 1999) y la represión de inhibidores de ciclo celular, como p15, p27 y p21 (Hermeking et al., 2000; Dang, 1999; Grandori et al., 2000).
Además, c-Myc activa el metabolismo y la síntesis de proteínas, controla tanto el crecimiento celular como el tamaño corporal, como se demostró en estudios realizados en Drosophila melanogaster (Johnston et al., 1999), y también en linfocitos B y hepatocitos de ratón (de Alborán et al., 2001; Baena et al., 2005). En cuanto a la apoptosis inducida, se describió que Myc acelera la muerte celular en condiciones de deprivación de factores de crecimiento (Askew et al., 1991; Evan et al., 1992). Esta inducción se produce mediante distinas vías de señalización (Fas-Fas ligando, TNF y TRAIL), que culminan en la activación de la cascada de caspasas y la consiguiente degradación celular (Hueber et al., 1997; Klefstrom et al., 1994; Lutz et al., 1998).
Por otro lado, c-Myc ha sido identificado como un factor regulador de la diferenciación a distintos tipos celulares. Puesto que el objetivo de esta tesis es el proceso de diferenciación B, vamos a centrarnos en este campo. La expresión de c-Myc en el linaje B comienza en la fase pro-B tras la estimulación con IL-7 (Morrow et al., 1992).
También se expresa en la población pre-B (Zimmerman et al., 1990). Esto animó a distintos grupos a estudiar el posible papel de c-Myc en la diferenciación de linfocitos B. Valiéndose de modelos de ganancia de función, como el modelo murino E¿-cmyc (Iritani et al., 1999), se describió un papel para este gen en la transición pro/ pre-B hacia células B inmaduras. También se ha estudiado el papel de c-Myc en la diferenciación de linfocitos B usando modelos de pérdida de función. Sin embargo, la letalidad embionaria en torno a día 10.5 de gestación causada por eliminación de c-myc en línea germinal (Davis et al., 1993) obligó a los investigadores a crear modelos condicionales de inactivación de c-Myc en tejidos adultos, creándose en 2001 el modelo c-mycflox en el cual la tecnología Cre/ LoxP permite la eliminación de c-myc en el ratón adulto (de Alborán et al., 2001). Estos ratones presentan una proliferación deficiente de linfocitos B en respuesta a anti-CD40 más IL-4, acumulándose en fase G0/G1, y mostrando un tamaño similar al de células no activadas. Además, poseen niveles anormalmente elevados de p27 y muestran resistencia a muerte inducida por la vía de Fas (de Alborán et al., 2001). Por otro lado, nuestro laboratorio ha descrito recientemente la regulación de la diferenciación temprana de linfocitos B por parte de c-Myc a través del factor de transcripción EBF1, gracias a la unión directa de c-Myc al promotor del gen ebf1 (Vallespinós et al. 2011, in press).
Aparte del papel descrito para c-Myc en diferenciación temprana de linfocitos B, este factor se expresa a distintos niveles a lo largo de todo el proceso de maduración, hasta que es inhibido cuando las células B maduras se diferencian a células plasmáticas (CP). El objetivo de esta tesis es estudiar la función de c-Myc en la diferenciación B terminal, puesto que creemos que puede estar jugando un papel importante, más allá del que juega en proliferación. No hay muchos estudios sobre este tema, pero se publicó un trabajo con la línea de linfoma B maduro BCL1 in vitro, en el cual se dice que la represión de c-myc es necesaria pero no suficiente para promover la diferenciación plasmacítica (Lin et al., 2000). Sin embargo, este trabajo deja una puerta abierta al requerimiento de c-Myc en las primeras fases de la diferenciación terminal de linfocitos B.
Vamos a repasar las distintas fases y algunos aspectos importantes del proceso de diferenciación de linfocitos B. La diferenciación B termpana es un proceso finamente regulado que ocurre en el hígado fetal o en la médula ósea adulta, desde progenitores linfoides hasta células B maduras. Está ligado al reordenamiento de los segmentos V(D)J de las cadenas pesada (IgH) y ligera (IgJ) de las inmunoglobulinas (Ig). El avance a lo largo de este proceso está acompañado de la expresión de varios marcadores de membrana que permiten la identificación de distinas subpoblaciones (Hardy et al., 2001). Una vez las células B han alcanzado la fase de células B maduras migran a los órganos linfoides periféricos, que incluyen los nódulos linfáticos, los parches de Peyer, las vegetaciones y amígdalas, el tejido linfoide asociado a las mucosas y la pulpa blanca del bazo. En estos órganos las células B naïve se activan mediante el reconocimiento de antígeno y se diferencian finalmente a CP y linfocitos B de memoria.
Las CP con las mediadoras de la inmunidad humoral, puesto que secretan grandes cantidades de Ig, y las células B de memoria permiten una rápida y eficiente respuesta ante la re-exposición al antígeno, y pueden perdurar durante toda la vida del organismo.
Nuestro trabajo se centra en el bazo de ratón, que se divide en pulpa roja, encargada de eliminar eritrocitos viejos, y la blanca, donde hallamos las células del sistema inmune. La pulpa blanca engloba los folículos, las zonas T (zona periarteolar o PALS) y la zona marginal. Las células que entran al bazo provenientes de la médula presentan el fenotipo de membrana IgMhiIgD+CD23intCD21int-hi y se llaman células B transicionales (T1 y T2). Éstas pueden poblar la zona marginal (MZ), entre las pulpas roja y blanca, u organizarse en folículos. Las células B de la zona marginal (IgMhiIgDloCd21hiCD21hiCD23lo) se activan en respuesta a antígenos T-independientes (TI), generando plasmablastos (células con capacidad proliferativa y de secretar bajos niveles de anticuerpos, con características intermedias entre linfocito B y CP) y CP de vida corta. Sin embargo, las células B foliculares (IgMloIgDhiCD21loCd23hi) pueden activarse mediante antígenos T-dependientes (TD), formando centros germinales (CG), que son estructuras especializadas en las cuales ocurren ciclos consecutivos de división celular. En ellos también tienen lugar los procesos de hipermutación somática (CSR) y maduración de la afinidad o hipermutación somática (SH), que permiten generar anticuerpos de diferentes isotipos (distintas región constante y función efectora) y con afinidades mayores por el antígeno. En estas estructuras se generan CP de vida larga y células B de memoria (McHeyzer-Williams et al., 2001; Vinuesa et al., 2001; Shapiro-Shelef et al., 2005).
Este proceso de diferenciación B terminal está controlado por un programa transcripcional altamente regulado, en el cual la expresión de los genes necesarios para la diferenciación y la activación de linfocitos B y la de los que controlan la diferenciación de CP son mutuamente excluyentes. Blimp-1, codificada por el gen prdm1, era considerado el principal regulador de la diferenciación plasmacítica, ya que su expresión induce la diferenciación hacia células secretoras de anticuerpos (Turner et al., 1994; Shapiro- Shelef et al., 2003). Sin embargo, se publicó que en ausencia de Blimp-1 es posible generar una población de células que secretan bajos niveles Ig aunque son Syndecan1- (un proteoglicano que se usa como marcador de CP (Sanderson et al., 1989)), pero ya expresan genes específicos de secreción de Ig como xbp1, flt3 e igj, gracias a la inhibición de pax5 (Kallies et al., 2007). Blimp-1 reprime directamente c-myc (Lin et al., 1997), por lo que las CP dejan de proliferar. La disminución de los niveles de Pax5 permite la expresión de Xbp-1, que es otro factor de transcripción esencial para la diferenciación a CP, puesto que establece el fenotipo secretor de estas células. Gracias a sus funciones relacionadas con la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), media la expansión del retículo endoplasmático (ER) , aumento del tamaño celular, síntesis de Ig y aumento de la función mitocondrial (Reimold et al., 2001). Irf4 también participa en este proceso de diferenciación, realizando funciones no solapantes con Blimp-1, y su eliminación inhibe la generación de CP.
Además, juega un papel en CSR a través de la activación directa de AID (Klein et al., 2996; Sciammas et al., 2006). Otro componente esencial de esta vía es Bcl-6, cuya expresión es máxima en los CG, debido a su función en el mantenimiento de estas estructuras (Cattoretti et al., 1995). Bcl-6 inhibe Blimp-1, por lo que debe ser reprimido para poder avanzar a lo largo del proceso de diferenciación hacia PC (Shaffer et al., 2000).
